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磷酸化蛋白多重檢測(cè)的方法分析
發(fā)布日期：
2018-06-26
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蛋白質(zhì)磷酸化由蛋白質(zhì)激酶所催化，磷酸化多發(fā)生在多肽鏈絲氨酸，蘇氨酸的羥基上，偶爾也發(fā)生在酪氨酸殘基上，這種磷酸化的過程受細(xì)胞內(nèi)一種蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白質(zhì)可以增加或降低它們的活性，例如：促進(jìn)糖原分解的磷酸化酶，無(wú)活性的磷酸化酶b經(jīng)磷酸化以后，變成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I經(jīng)磷酸化以后變成無(wú)活性的糖原合成酶D，共同調(diào)節(jié)糖原的合成與分解。以下簡(jiǎn)要介紹幾種常用的磷酸化蛋白多重檢測(cè)的方法。
1.westernblot
檢測(cè)蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法是westernblot，過程是先用SDS-PAGE分離生物樣品，接著轉(zhuǎn)移到膜上，后利用磷酸化特異的抗體來(lái)鑒定目的蛋白。典型的Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟避免了使用放射性同位素時(shí)的危險(xiǎn)品和廢物處理要求。磷酸化特異抗體大多十分靈敏，可輕松檢測(cè)常規(guī)樣品中的磷酸化蛋白。
2.酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
ELISA的定量能力比Westernblot更強(qiáng)，非常有助于研究激酶活性調(diào)節(jié)及其功能。這種微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特異的捕獲抗體，和磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測(cè)抗體。這些分析通常設(shè)計(jì)為顯色或熒光檢測(cè)。產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。
3.激酶活性分析
蛋白激酶通常是多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的常見組分，它們影響了眾多負(fù)責(zé)生物反應(yīng)的下游效應(yīng)物，因此，評(píng)估某個(gè)特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性通常是在體外測(cè)定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報(bào)告系統(tǒng)來(lái)評(píng)估特定激酶對(duì)底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測(cè)。
4.磷酸化特異抗體的開發(fā)
20世紀(jì)90年代，科學(xué)家利用合成的磷酸化肽段來(lái)免疫兔子，開發(fā)出多個(gè)磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標(biāo)蛋白磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)方法的改進(jìn)以及新的免疫分析技術(shù)的開發(fā)打開了大門。在任何技術(shù)中使用磷酸化特異抗體都要注意，成功的檢測(cè)依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。
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