磷酸化蛋白檢測試劑盒適用于從各種原代或傳代細胞和各種實體組織，如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等哺乳動物組織中提取磷酸化蛋白。提取過程簡單方便，可在1小時內(nèi)完成。該試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。本試劑盒含有的*配方能夠溶解細胞膜包括細胞質(zhì)膜和核膜。提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。

　　一、試劑準備

　　1.1配制適當體積的2.0mol/LNaOH、4.7mol/LHCl和50mmol/LTris-HClBuffer（pH7.5）溶液。

　　1.2按照以下公式計算所需的檢測液總體積。

　　檢測液總體積=（標準曲線測定點數(shù)+樣品數(shù)+空白數(shù)）×重復次數(shù)×每個樣品所需的檢測液體積

　　1.3根據(jù)所需的檢測液總體積，取1體積試劑A和3體積試劑B，充分混勻，制成檢測液。

　　1.4取7支1.5mL離心管，按照下表平行操作。

　　管號

　　所加溶液0123456

　　0.05MTris-HClBuffer（?L）500495490480470460450

　　磷酸化標準蛋白溶液（?L）

　　磷酸化標準蛋白終濃度（?g/ml）01020406080100

　　二、離心管法

　　2.1制作標準曲線

　　2.1.1取7支1.5mL離心管，各管分別加入200?L各濃度的磷酸化標準蛋白溶液。

　　2.1.2各管加入200?L2.0mol/LNaOH，混勻。

　　2.1.365℃水浴，保溫30min。

　　2.1.4待溶液冷卻至室溫后，各管加入200?L4.7mol/LHCl，混勻。

　　2.1.5各管加入200?L檢測液，混勻。

　　2.1.6室溫靜置30min，期間混勻1-2次，進行吸光度值檢測前再混勻1次。

　　2.1.7以0號管作為空白對照，在分光光度計上測各管的A620值。

　　2.1.8重復步驟2.1.1-2.1.7，并計算出編號相同的兩管中磷酸化標準蛋白濃度的A620值的平均值。

　　2.1.9以各管A620平均值為縱坐標，對應(yīng)的磷酸化標準蛋白終濃度為橫坐標，在坐標紙上或MicrosoftExcel軟件中繪制標準曲線。

　　2.2未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定

　　2.2.1將待測樣品做適當倍數(shù)的稀釋或濃縮。

　　2.2.2取3支1.5mL離心管，其中一管加入200?L0.05M的Tris-HClBuffer作為空白對照，其余兩管分別加入200?L相同濃度的待測樣品稀釋液或濃縮液。

　　2.2.3按照步驟2.1.2-2.1.6進行實驗。